Jul 26, 2023
기본적이고 측정 가능한 분광 특성과 연결된 발광 입자 산란의 효율성 척도
Scientific Reports 13권, 기사 번호: 6254(2023) 이 기사 인용 547 액세스 측정항목 세부정보 분자 및 나노규모 발광단과 발광 마이크로 및 발광단의 성능 비교
Scientific Reports 13권, 기사 번호: 6254(2023) 이 기사 인용
547 액세스
측정항목 세부정보
분자 및 나노 규모의 발광단과 발광 마이크로 및 나노 입자의 성능을 비교하고 달성 가능한 신호 진폭과 검출 한계를 추정하려면 표준화 가능한 강도 규모가 필요합니다. 이로 인해 유세포 분석 및 형광 현미경 검사를 위한 상대 MESF(등가 용해성 형광 색소의 분자 수) 및 ERF(등가 참조 형광단) 스케일의 개발이 시작되었습니다. 두 강도 스케일 모두 분광형광계를 사용하여 알려진 농도의 스펙트럼적으로 밀접하게 일치하는 형광단 용액과의 강도 비교를 통해 형광 교정 비드에 할당된 형광 강도 값에 의존합니다. 대안적으로, 발광단 또는 비드 밝기(B)는 여기 파장(σa(λex))에서의 흡수 단면적(σa)과 광발광 양자 수율(Φpl)의 곱과 동일하게 결정될 수 있습니다. 이로써 입자 크기, 재료, 발광단 염색 또는 라벨링 밀도와 무관하고 환경에 대한 발광단의 광학적 특성 민감도를 고려하는 기본적이고 측정 가능한 분광 특성을 기반으로 한 절대 규모를 실현할 수 있습니다. 크기가 수십 나노미터를 초과하는 발광 입자의 광 산란 분산에 대한 밝기 척도를 확립하는 것을 목표로 우리는 다양한 농도의 두 가지 다른 염료는 Φpl의 절대 측정과 투과율 및 확산 반사율 측정을 가능하게 하는 단일 맞춤 설계 적분구 설정을 통해 얻을 수 있습니다. 결과 Φpl, σa(λex), 굴절률의 허수부 및 이러한 샘플의 계산된 B 값은 입자당 통합된 염료 분자 수에 따라 제공됩니다. 마지막으로, 단위 없는 발광 효율(LE)이 정의되어 다양한 크기의 입자의 발광 효율을 직접 비교할 수 있습니다.
지난 수십 년 동안 다양한 유형의 분자 및 나노결정질 발광단으로 염색되거나 인코딩된 나노입자(NP) 및 미세입자(MP)가 생명 과학 및 재료 과학에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 일반적인 응용 분야는 인쇄 가능한 인증 태그를 통한 형광 분석 및 생체 이미징 및 약물 전달 시스템을 위한 광학 리포터와 유세포 분석, 형광 현미경 및 면역 분리를 위한 비드 기반 플랫폼부터 다양한 형광 방법, 특히 유세포 분석을 위한 입자 센서 및 교정 도구에 이르기까지 다양합니다1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. 형광 분광법, 미세형광측정법, 형광 현미경법 및 유세포 분석법과 같은 방출성 NP 및 MP를 활용하는 대부분의 형광 방법은 기기별 상대 형광 강도만 측정합니다. 다양한 기기와 실험실 간의 형광 측정을 안정적으로 비교하려면 측정된 방출 스펙트럼에 영향을 미치는 기기 감지 채널의 파장 의존적 스펙트럼 응답성과 같은 기기별 신호 기여도를 결정하고 고려하기 위한 기기 교정이 필요합니다. 예를 들어 분석물의 정량화 또는 다양한 형광 기술을 사용한 다양한 형광 샘플의 비교를 위해 일반적으로 알려진 농도, 발광 특성 및 특히 방출 스펙트럼과 거의 일치하는 방출 스펙트럼의 형광단 용액을 사용하여 형광 강도 척도의 상대적 교정이 수행됩니다. 샘플 측정에 적용된 것과 동일한 기기 설정을 활용하는 샘플17. 이는 형광 검출 기능이 있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피 분리 기술을 사용한 감지 응용 또는 발광단 정량화와 같은 투명한 발광 샘플의 경우 간단하지만 광산란 시스템의 경우에는 어렵습니다. 그러나 널리 사용되는 형광성 NP 및 MP의 대부분의 분산액은 크기, 굴절률 및 입자 환경에 따라 여기광을 산란시킵니다. 이는 형광 측정 특성화, 특히 투명한 샘플 측정용으로 설계된 일반적인 분광 광도계 및 분광 형광 측정기를 사용한 흡수 기능 측정에 영향을 미칠 수 있습니다.
0). The normalized absorbance and emission spectra of aqueous dispersions of these differently sized PSP loaded with Nile Red and Itrybe are displayed in the SI in Fig. S5. Due to the dye staining of the particles via a previously optimized swelling procedure assessed, e.g., microscopy, the dye molecules can be assumed to be homogeneously distributed within the particles, and the spherical shape of the particles is preserved in the process.12,41,42,44 This allows for a data analysis based on Mie Theory, like with the unstained particles discussed above. The absorbance and emission spectra of Itrybe-loaded PSP are broadened compared to the parent molecule in ethanol, yet the respective absorption and emission maxima match. In the case of solvatochromic Nile Red, the absorbance and emission bands of Nile Red-stained PSP are red shifted with decreasing PSP size, pointing to an increasingly polar microenvironment faced by the dye molecules with reduced PSP size and hence increased surface-to-volume ratio. The corresponding \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of aqueous dispersions of Nile Red- and Itrybe-loaded PSPs in dependence on PSP size and loading concentration, i.e., the average dye-dye distance are shown in Fig. 4. This figure reveals opposite trends for the particle size- and dye loading-dependent \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of both dyes. As shown in the left panel of Fig. 4, the \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) values of Nile Red-stained PSP decreased with decreasing PSP size and increased surface-to-volume ratio. In contrast, for PSP containing Itrybe molecules, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) decreased with increasing particle size (right panel of Fig. 4. For both dyes, an increase in dye loading concentration resulted in a diminution of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (see also SI, Fig. S7). We attribute these trends to (1) the influence of the polar particle environment particularly in the case of the charge transfer dye Nile Red, the fluorescence of which is known to be quenched by hydrogen bonding interactions and polarity as follows also from the solvatochromic emission behavior of Nile Red (see SI, Fig. S5), (2) dye-dye interactions, and (3) energy transfer processes between dye molecules in the PSP. The latter two factors are supported by the dependence of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) on dye loading concentration (see Fig. 4 and SI, Fig. S7)66,67,68,69,70. µa(λ) and µs(λ) of the dispersed 1 µm and 100 nm dye loaded PSPs determined by radiation transport and Mie Theory are shown in Fig. 5. For the 25 nm sized particles the scattering contributions were too small to be used for quantification and represent the physical size limit for our study and method development. For the fit of µa(λ) and µs(λ), we considered the contribution of the dye molecules to the dielectric function of the particle matrix by increasing the imaginary part of the refractive index. In a first step, n2 was used as a free variable and it was assumed that the particle matrix is homogeneously loaded with dye molecules. The resulting σa(λ) values are shown in Fig. 6. The resulting Np and rp values were also used for the determination of σa(λ) from µa(λ) calculated from the radiation transport theory. For the particle sizes and dye concentrations used here, the direct determination of σa(λ) from Mie calculations and calculations using radiation transport theory are in good agreement as displayed in Fig. 5./p>3.0.co;2-i" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819960315%2926%3A1%3C22%3A%3Aaid-cyto4%3E3.0.co%3B2-i" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:13.0.co;2-i"Article CAS PubMed Google Scholar /p>3.0.CO;2-X" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C213%3A%3AAID-CYTO16%3E3.0.CO%3B2-X" aria-label="Article reference 22" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:23.0.CO;2-X"Article CAS PubMed Google Scholar /p>3.0.co;2-q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C188%3A%3Aaid-cyto13%3E3.0.co%3B2-q" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:23.0.co;2-q"Article CAS PubMed Google Scholar /p>
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